Galego
A embrioxénese somática consiste na produción de embrións a partir de células puramente somáticas cultivadas in vitro e en total ausencia do proceso de fecundación. A aplicación máis inmediata da embrioxénese somática nas plantas é debida á súa enorme capacidade de rexeneración de plantas, do cal se deriva o seu potencial para a propagación in vitro.
Ademais, constitúe unha excelente ferramenta para o estudo do proceso de formación dos embrións e para o desenvolvemento de aplicacións enfocadas á mellora xenética das plantas.
Na vide, a embrioxénese somática é coñecida dende a década dos anos 50, e obtense normalmente a partir de tecidos somáticos de órganos florais, como as anteras ou os ovarios. Nos últimos anos no laboratorio do Profesor Manuel Rey, da Universidade de Vigo, desenvolvéronse sistemas de embrioxénese somática en seis cultivares autóctonos de Galicia, tres brancos (Albariño, Treixadura e Torrontés) e tres tintos (Mencía, Brancellao e Merenzao), utilizando inflorescencias recollidas en campo en estado de acios separados.
Neste estado, a competencia dos tecidos para producir embrioxénese somática está relacionada co desenvolvemento das microsporas, que deben estar entre os estados uninucleado e binucleado. Este estado de desenvolvemento determínase no laboratorio antes de iniciar os cultivos utilizando unha tinguidura fluorescente. A continuación, os órganos que conteñen os tecidos competentes (estames e ovarios) extráense en condicións asépticas e cultívanse nun medio de indución de embrioxénese somática.
Este medio, entre outros compoñentes (sales minerais e vitaminas principalmente), contén fitohormonas, concretamente unha auxina(ácido diclorofenoxiacético ou 2,4-D) que é a responsable específica da indución da embrioxénese somática, e unhacitoquinina que favorece a división das células e polo tanto a resposta. Dependendo da citoquinina utilizada pódense obter dúas rutas de embrioxénese somática alternativas.
O primeiro protocolo desenvolvido utiliza bencil-adenina (BA) comocitoquinina, o cal produce que a resposta teña lugar a partir dos tecidos somáticos das paredes das anteras e dos ovarios, producíndose un calo embrioxénico ao cabo dun mínimo de 6 meses de cultivo. Un calo embrioxénico é unha masa de células sen organización definida, que contén as células que van dar lugar aos embrións somáticos.
Mais recentemente estableceuse un protocolo alternativo, que é o que se utiliza rutineiramente na actualidade, empregando TDZ(tidiazurón, unha molécula sintética) como citoquinina, sendo o resto de compoñentes do medio de indución exactamente estes. Nestas condicións, o modelo de indución cambia radicalmente, obténdose embrioxénese somática de forma directa, é dicir, sen a formación de calo, soamente a partir dos filamentos dos estames, e en tan só 3 meses de cultivo.
Como xerar unha planta de vide a partir dun embrión?
Os cultivos de embrións mantéñense in vitro no mesmo medio de indución. Para a rexeneración final dunha planta normal a partir de cada un deles séguense unha serie de pasos perfectamente definidos. En primeiro lugar, os embrións deben completar o seu desenvolvemento e madurar correctamente, incluíndo a súa entrada en durmición para despois xerminar normalmente, ao igual que os embrións cigóticos presentes nas sementes.
Iso conséguese cultivándoos sobre unha membrana semipermeable nun medio de diferenciación sen fitohormonas. Con iso conséguese un desecamento parcial que provoca o aumento do contido endóxeno da fitohormona ácido abscísico e a ralentización do crecemento dos embrións.
Unha vez completado o seu desenvolvemento, os embrións maduros individualízanse e transfiren medio de xerminación. Finalmente, os embrións xerminados transfírense a outro medio denominado de conversión a planta, onde ten lugar a formación dunha planta normal a partir do embrión xerminado.
Mediante a embrioxénese somática permite mellorar a investigación en viticultura
O principal interese científico para o noso grupo é o estudo fisiolóxico e molecular do proceso de embrioxénese somática. Non obstante, o desenvolvemento de métodos de traballo aplicables ao estudo deste proceso en particular, dá lugar a aplicacións mais directamente relacionadas coa viticultura, como son a identificación e a análise da variabilidade natural presente no viñedo, ou a análise genómico de carácteres de interese para a viticultura en distintos aspectos.
Polo tanto, a utilización de ferramentas biotecnolóxicas como a embrioxénese somática ofrece oportunidades de investigación en viticultura, en particular debido á dispoñibilidade de dous borradores da secuencia do xenoma da vide, ambas as dúas baseadas en cultivar francés Pinot Noir. O xenoma da vide é de tamaño medio, contendo aproximadamente 485 millóns de pares de bases nucleotídicas agrupadas en 19 pares de cromosomas.
Como parte fundamental do desenvolvemento da embrioxénese somática, se avalía a estabilidade xenética dos cultivos mediante citometría de fluxo, debido a que a forma máis frecuente de alteracións xenéticas durante o cultivo in vitro son os cambios cromosómicos. A estabilidade xenética dos cultivos embrioxénicos no noso laboratorio é de arredor do 95% por regra xeneral. No 5% restante, as principais alteracións cromosómicas que se observaron foron sobre todo a presenza de plantas tetraploides. Unha planta de vide é tetraploide porque cada célula contén 4 pares de cromosomas, que é o dobre que nas plantas normais diploides. Ademais, observouse algunha planta octoploide (8 pares de cromosomas) e mixoploide (plantas que conteñen simultáneamentecélulas normais diploides e células tetraploides). En case todos os casos, as alteracións debéronse ao proceso de cultivo in vitro, posto de manifesto porque as plantas de campo orixinais utilizadas como controis non presentaron ningunha alteración deste tipo.
Unicamente observouse unha proporción anormalmente alta de plantas rexeneradas de xenotipo tetraploide no cv. Brancellao. A análise por citometría de fluxo das plantas orixinais de campo deste cultivar indicou que a metade das súas mostras contiñan xenotipos mixoploides, cun pico correspondente aos núcleos diploides e simultáneamente outro correspondente aos núcleos tetraploides. A conclusión é que a embrioxénese somática se produciu a partir de células con dous niveis de ploidía, dando lugar a plantas enteiramente diploides por un lado e por outro plantas enteiramente tetraploides. Iso é posible debido a que os embrións somáticos na vide son de orixe unicelular, feito que non sucede igualmente en todas as plantas.
Identificación xenética dá vide mediante microsatélites
Outro método de identificación xenética dispoñible no noso laboratorio é a análise por microsatélites, os marcadores moleculares máis utilizados na vide. Os microsatélites son pequenas secuencias (2-6 nucleótidos) de ADN que se repiten consecutivamente entre 5 e 100 veces. Son útiles como marcadores xenéticos porque as diferenzas entre os distintos cultivares de vide débese a variacións no número de repeticións da secuencia característica de cada microsatélite.
O xenotipo dun microsatélite determínase realizando unha reacción específica de PCR (reacción en cadea da polimerasa) e analizando o produto da reacción mediante un secuenciador automático deADN. Os resultados proporciónanse anotando numericamente a lonxitude da secuencia de ADN de cada microsatélite. Como a vide é diploide, contén dúas copias da secuencia de cada microsatélite, que poden ser idénticas (planta homocigota para ese microsatélite) ou distintas (heterocigota).
Mediante esta análise elaboramos unha base de datos de microsatélites baseada nos xenotipos de 9 microsatélites para 7 cultivares de vide. Esta base de datos pódese aplicar á análise de estabilidade dos embrións somáticos xerados no noso laboratorio. Así, observamos que todas as plantas rexeneradas mediante embrioxénese somática eran conformes ao xenotipo normal de microsatélites en todos cultivárelos estudados. Unicamente encontramos algunhas plantas de cultivar Torrontés que presentaron unha mutación consistente nunha deleción (eliminación) de 6 nucleótidos nun microsatélite, feito bastante infrecuente xa que como se comentou anteriormente, a forma máis frecuente de alteracións xenéticas é o cambio no número de cromosomas.
A embrioxénese somática tamén é útil para xerar mutacións que sirvan para a análise genómico na vide. É dicir, pódense xerar embrións somáticos con mutacións puntuais en xenes determinados que nos permitan obter información sobre a súa función. Isto tamén é posible debido á orixe unicelular dos embrións somáticos, así como na reducida taxa de alteracións xenéticas que produce o noso protocolo de embrioxénese somática.
Estas mutacións pódense xerar no noso laboratorio utilizando un axente mutáxeno, o etilmetano sulfonato (EMS), que provoca mutacións puntuais no ADN, e que son identificables mediante métodos moleculares. Isto permite a análise dos determinantes xenéticos que controlan a bioloxía da especie en todos os seus aspectos, incluíndo os derivados da práctica vitivinícola, resistencia a enfermidades ou carácteres de calidade.
